酸性橙，又叫“酸性金黄”，是皂黄(Metanil yellow)的别称，相对分子质量452.38℃主要用于纺织品、皮革制品、塑料及木制品的染色。酸性橙Ⅱ为中等毒性致癌化合物，禁止在食品中使用。由于酸性橙具有色泽鲜艳，着色稳定，价廉，经长时间烧煮、高温消毒而不分解褪色等特点，一些不法商贩为使卤制品卖相好看，可能存在非法添加。酸性橙Ⅱ的测定方法有纸层析法和分光光度法等，这些方法操作时间长，定量精度差。而高效液相色谱(HPLC)法测食品中酸性橙Ⅱ的方法快速、准确，适用于食品中合成食用色素与非食用色素酸性橙Ⅱ的同时测定。

(一)实验原理

食品中非食用色素酸性橙Ⅱ经提取制成水溶液，注入高效液相色谱仪，经反相色谱分离，根据保留时间定性，采用外标法进行定量。

(二)试剂和仪器

1．试剂

(1)重蒸馏水、乙酸、甲醇(色谱纯)、聚酞胺粉(过200目筛)、乙酸铵溶液(0.02mol/L)、柠檬酸溶液、无水乙醇-氨水-水溶液、酸性橙Ⅱ、柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄。

(2)酸性橙Ⅱ标准溶液准确称取干燥的酸性橙标样0.1000g，蒸馏水溶解，定容至100mL，此溶液1mL含1. 00mg酸性橙Ⅱ。临用时，用蒸馏水稀释至1mL含10mg的酸性橙Ⅱ标准使用液。

(3)混合着色剂标准溶液准确称取按其纯度折算为100％质量的柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、酸性橙Ⅱ各0.100g，置100mL容量瓶中，加水(pH=6)到刻度，配成水溶液(1.00mg/mL)，临用时，用水稀释经0. 45 um滤膜过滤，配成每毫升含各种标准物质101g的混合着色剂标准使用液。

2．仪器

高效液相色谱仪：Waters 515泵，Waters紫外可见波长检测器；KQ-100DB型数控超声波清洗器；离心机。

(三)实验步骤

1．样品处理

(1)液体样品饮料实验前，对于含二氧化碳试样应预先加热驱除二氧化碳；配制酒类加热驱逐乙醇，可不经稀释，过0.45um滤膜后测定。

(2)固体样品糕点类、卤制品类、灌制品类、辣椒面等样品，称样5.00～10.00g，粉碎混匀，加无水乙醇-氨水-水(70+1+29)溶液20mL，振摇0.5h，过滤，洗滤渣2次，合并滤液，用水(pH6)定容，过0.45um滤膜测定。

(3)乳制品可称量5.00g试样，按GB5009.23-2003聚酰胺吸附法提取色素，经0.45um滤膜过滤测定。

2. 液相色谱参考条件

色谱柱：DiamonsilTM(钻石)C18 5um, 4.6mm×200mm色谱柱；流动相：A : 0.02mol/L甲醇；B:醋酸铵；流速：1.0mL/min，梯度洗脱；进样量：20 uL ;柱温：室温；紫外可变波长检测器：λ=484nm；流动相的选择：采用甲醇＋醋酸铵体系作流动相，试剂价格便宜、易得，采用梯度洗脱可以同时测定柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄。

3．线性范围

对酸性橙Ⅱ在0～200ug/mL的范围内配制标准溶液系列9点，每标样进3针，以标样的峰面积的平均值为纵坐标，以标样的浓度为横坐标，绘制标准曲线，并利用最小二阶乘法进行线性回归，得到在0～100ug/mL范围内的线性方程。

文章来源：《食品质量与安全检测技术》

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